動(dòng)物臟器組織單核細胞分離液實(shí)驗方法

“XXXX”動(dòng)物臟器組織單核細胞分離液實(shí)驗方法

【產(chǎn)品規格】

2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內容如下：

【檢驗方法】

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

1.首先制備臟器組織單細胞懸液，制備方法詳見(jiàn)“組織單細胞懸液制備技術(shù)”。

2.取一支 15ml 的離心管，依次小心加入試劑 A、試劑 D（體積比為 3:2，試劑總量與樣本量相等。如臟器組織單細胞懸液為 5ml，則先后加入試劑 A 3ml、試劑 D 2ml），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

3.用吸管小心吸取臟器單細胞懸液樣本加于分離液液面上，400-550g，離心 20-30min（注：根據臟器單細胞懸液量確定離心條件，樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(cháng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達到*分離效果）。

4.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為五層。*層為稀釋液層。第二層為透明試劑 D 液層。第三層為環(huán)狀乳白色單核細胞層。第四層為透明試劑 A 液層。第五層為紅細胞層。

5.用吸管小心吸取第二層試劑 D 層和第三層乳白色細胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。

6.250g，離心 10min。

7.棄上清。

8.用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

9.250g，離心 10min。

10.重復 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續實(shí)驗所需相應液體重懸細胞。

差異貼壁法純化細胞

（1）用單核細胞無(wú)血清培養基（產(chǎn)品編號：CTBD2011）或單核細胞*培養基（產(chǎn)品編號：HCTBD2011）以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次性細胞板或細胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養箱中進(jìn)行貼壁培養。

（2）2-4 小時(shí)內貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱(chēng)為單核細胞）。

（3）10-24 小時(shí)內貼壁的單個(gè)核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。（4）不貼壁的為淋巴細胞。注：

a）無(wú)血清培養基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。

b）*培養基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養的目的細胞而定）。

c）由于每種細胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細胞分開(kāi)已達簡(jiǎn)單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰性分選。

【注意事項】

1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗結果，在取樣 2h 內進(jìn)行實(shí)驗，樣本存放時(shí)間越長(cháng)，細胞分離效果越差。樣本放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

2.本實(shí)驗不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì )變成毛面，影響細胞分離效果。

3.吸取過(guò)多的單核細胞層及分離液層會(huì )導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加。

4.分離液用量大于臟器組織單細胞懸液樣本量時(shí)，分離效果更佳。

5.如實(shí)驗后細胞得率或活性過(guò)低，請天津灝洋以尋求幫助，具體詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

【儲存條件及有效期】

18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟

封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗單核細胞提取率大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶(hù)可適當進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗技術(shù)方案】

臟器組織單細胞懸液制備技術(shù)。

所獲得單核細胞的培養技術(shù)。

所獲得單核細胞的核酸提取技術(shù)。

所獲得單核細胞的鑒定方法A.流式細胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

1.由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區客戶(hù)可根據當地情況對離心條件進(jìn)行適當調整。建議對離心條件進(jìn)行調整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對離心轉速進(jìn)行調整。

3.本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可能出現紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉速。

注：在對離心條件進(jìn)行調整時(shí)，離心轉速的加減以 50-100g 為基數，直至達到*分離效果，

離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準。