--組織單細胞懸液的制備方法

組織單細胞懸液的制備

（全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境）

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剪碎法：

將組織塊放入平皿后，加入少量PBS+10%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入10 ml PBS+10%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用100 目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾到試管內；離心沉淀1500 rpm×3 min，再用PBS+10%胎牛血清洗3 次，每次以500 rpm 短時(shí)低速離心除去細胞碎片，以200 目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾去細胞團塊。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107 /ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用胎牛血清懸起細胞濃度為1×107/ml 的單細胞懸液備用。

勻漿器法：

用眼科剪將組織剪成小塊；放入70 ml 組織研磨器內，加入2 ml PBS+10%胎牛血清；緩慢轉動(dòng)研棒，研磨至勻漿；用10 ml PBS+10%胎牛血清沖洗研器；收集細胞懸液，經(jīng)200 目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾；離心沉淀800 prm×2 min ，再用PBS 洗3 次，離心沉淀。以下處理同剪碎法。

細胞計數方法：

細胞計數法是用來(lái)計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用計數板（血球計數板）進(jìn)行。即可用于分離（散）細胞培養接種前計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，也可用于對培養物的細胞數量進(jìn)行計數。不論計數的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。

計數與計算過(guò)程：

1）、在細胞計數板中央放置計數的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹蹧處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿(mǎn)為止。

3）、置顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數。對于壓線(xiàn)的細胞只計數在上線(xiàn)和左線(xiàn)者，對于細胞團按單個(gè)細胞計數。

4）、按下式計數細胞懸液的密度：細胞密度＝（4 個(gè)大格細胞總數/4）×104 個(gè)/ml ×稀釋倍數公式中乘以104 因為計數板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長(cháng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

細胞計數要點(diǎn)：

1.進(jìn)行細胞計數時(shí)，要求懸液中細胞數目不低于104 個(gè)/ml，如果細胞數目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養液中；顯微鏡下計數時(shí)，遇到2 個(gè)以上細胞組成的細胞團，應按單個(gè)細胞計算。如果細胞團>10％，說(shuō)明細胞分散不充分; 或細胞數<200 個(gè)/10mm2 或>500 個(gè)/10 mm2時(shí)，說(shuō)明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。

2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

3.取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；

4. 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時(shí)，只按照一個(gè)細胞計算。如果細胞壓在格線(xiàn)上時(shí)，則只計上線(xiàn)，不計下線(xiàn)，只計左線(xiàn)，不計右線(xiàn)。

5. 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑?，否則要重新計數。

初學(xué)者易犯的錯誤：

1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。

2. 滴入細胞懸液時(shí)蓋玻片下出現氣泡。

3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

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