β-內酰胺酶的檢測方法

β-內酰胺酶的檢測方法

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1.常規方法

（1）.微生物法：

[原理]以一種對青霉素高度敏感的細菌-枯草芽孢桿菌作為指示劑，試驗時(shí)如果被測細菌株產(chǎn)生青霉素酶，破壞了青霉素，則此高度敏感菌株即可生長(cháng)，否則，指示劑則被抑制。

[方法]以枯草芽孢桿菌為指示菌，用棉拭子將枯草芽孢桿菌接種于瓊脂培養基上，或傾注方法將枯草芽孢桿菌混于瓊脂平板內。然后將被測菌與產(chǎn)青霉素酶陽(yáng)性及陰性對照菌株，按下圖接種劃線(xiàn)，在瓊脂培養基中央放置一含青霉素G（1單位）紙片。放置35℃培養24小時(shí)后觀(guān)察結果。

[結果判斷]如被檢菌產(chǎn)生青霉素酶，則沿著(zhù)被測菌處的枯草芽孢桿菌抑菌環(huán)出現凹痕。

（2）.碘量法^[3]

[原理]β-內酰胺酶能裂解青霉素的β-內酰胺環(huán)形成青霉噻唑酸，它與淀粉競爭游離碘，破壞了碘和淀粉的蘭色復合物，使蘭色變?yōu)闊o(wú)色。

[方法]

①將0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度成6000ug/ml。取0.1ml于一小試管中。

②將培養18-24小時(shí)的細菌在含青霉素試管內制成濃厚菌懸液（10^9/ml）。

③在37℃水浴中放置30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)，使酶能破壞青霉素。

④加入1%可溶性淀粉溶液0.5ml，搖勻。

⑤加入碘液0.02 ml。

⑥在37℃水浴中放置10分鐘，觀(guān)察結果。

[結果]在10分鐘內能使蘭色*消退的菌株為β-內酰胺酶陽(yáng)性，不消退者為陰性。

[注意事項]

①由于青霉素很容易分解，因而用于實(shí)驗的青霉素應新鮮配制。

②淀粉也新鮮配制，在100ml蒸餾水中加入1克可溶性淀粉，放到開(kāi)水中水浴直到淀粉溶解。

③實(shí)驗應按照步驟操作，如果碘加得過(guò)早，酶反應就會(huì )停止，產(chǎn)生假陰性結果。

④每次試驗用陽(yáng)性和陰性對照。

（3）.紙片酸度定量法^[3]

[原理]β-內酰胺酶能破壞青霉素中的β-內酰胺環(huán)，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示劑溴甲酚紫顏色由紫變黃。

[方法]

①將一小片Whatman濾紙放于空平皿中。

②讓濾紙吸足青霉素溶液（0.05M磷酸緩沖液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%無(wú)緩沖劑的結晶青霉素）。

③用接種環(huán)把10-20個(gè)菌落涂到濾紙上，

④蓋好平皿后，將濾紙片在37℃孵育30分鐘，觀(guān)察結果。

[結果] 產(chǎn)β-內酰胺酶的菌株使濾紙顏色由蘭色變黃色，一般在10分鐘內即能看到。

（4）.產(chǎn)色頭胞菌素法^[4]

[原理]產(chǎn)色頭胞菌素如頭胞硝噻吩（nitrocefin）的β-內酰胺環(huán)能被β-內酰胺酶所破壞，使其顏色由淺黃色變?yōu)榉奂t色，以此來(lái)測定細菌的產(chǎn)酶情況。

[方法]將頭胞硝噻吩（nitrocefin）紙片置于干凈的平皿內，用無(wú)菌的牙簽或接種環(huán)挑取細菌菌落涂于紙片上，觀(guān)察紙片有無(wú)顏色變化。

[結果]紙片涂抹處如顏色由淺黃色變成粉紅色，表示該菌產(chǎn)生β-內酰胺酶，如顏色不變，表示細菌不產(chǎn)生β-內酰胺酶。

檢測β-內酰胺酶方法中，生物學(xué)方法是古老的方法，由于特異性差、靈敏度低，現在基本上很少被采用，頭胞硝噻吩（nitrocefin）主要檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）、葡萄球菌，結果可靠。紙片酸度定量法一般用于檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌。碘量法常用于檢測淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉漢氏菌）只能用頭胞硝噻吩（nitrocefin）法。

對于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）快速測定β-內酰胺酶比做藥敏試驗能更快地得到臨床需要的結果。β-內酰胺酶試驗還可驗證葡萄球菌對紙片法青霉素的敏感試驗結果是否可信。腸桿菌科、假單胞菌科及其它需氧革蘭氏陰性桿菌不必測定β-內酰胺酶，因其結果常常不能預測這類(lèi)細菌對臨床常用來(lái)治療β-內酰胺類(lèi)抗生素藥物的敏感性^[5]。